Hvem opdagede RNAi

Richard Jorgensen fra University of Arizona – et barnebarn af en dansker, der som 4-årig i 1880'erne rejste med sine forældre til Wisconsin i USA – var den første som så effekten af RNAi. Han studerede petunia, og et billede af petuniaen "Cossack Dancer" blev bragt på forsiden af det videnskabelige tidsskrift The Plant Cell i april 1990. Artiklen handlede om, hvordan indsættelse af flere kopier af et gen kunne medføre, at genets virkning højst overraskende fuldstændig op­hørte med at fungere. Forklaringen fik man først 8 år senere.

Hvordan blev RNAi opdaget?

Det blev opdaget ved tilfældighed – Richard Jorgensen kendte genet, som gør Petunia-kronblade violette. Man troede naturligvis, at blomsten ville blive mere mørkviolet, hvis nogle ekstra kopier af dette gen blev indsat i planten, men i stedet kom der hvide partier i blomsten. Umiddelbart kunne forskerne nu konstatere, at genet for violet farve var blevet slået helt ud – og at også de indsatte ekstra kopier af genet havde mistet deres effekt i planten. Der var ikke noget i vejen med selve genet, (dvs. det DNA, som genet opbygges af). Det var derfor kun genets proteindannende egenskab, som var stoppet.

Hvor findes RNAi?

Det samme fænomen blev hurtigt fundet i andre planter, men man fandt også samme mekanisme hos mikroorganismer – og senere i celler hos pattedyr og mennesker.

Hvorfor findes RNAi i så mange organismer?

Når det gælder basale fænomener er der ikke langt fra en menneskecelle til en plante- eller bakteriecelle.

Hvad er forklaringen på RNAi?

Forklaringen på fænomenet fik man i 1998, fra Andrew Fire fra Johns Hopkins University i Baltimore, som under sit arbejde med en rundorm opdagede, at optagelse af små dobbeltstrengede RNA-stumper virker som grus i det maskineri, som i cellen frembringer protein. Så snart der i cellen dannes dobbeltstrenget RNA stopper dannelse af det proteinmolekyle, som det var meningen skulle dannes ud fra koden i dette RNA.

Hvordan aflæses et gen?

Et gen er opbygget af DNA, men aflæsningsvejen af dets kode er: DNA -> mRNA -> protein

Hvad er RNA?

RNA kan betragtes som en slags arbejdskopi af DNA-genets kode. At et gen er "aktivt" vil sige, at det – via mellemproduktet RNA – "udtrykkes" i form af dannelse af et specifikt protein. Det er vigtigt for forståelsen af RNAi-teknikken, at genets kode altså ikke oversættes direkte til protein – det sker via den arbejdskopi af genet, som kaldes meddeler-RNA (messenger-RNA, mRNA).

Hvordan dannes proteiner ud fra RNA?

Når mRNA fra cellekernen transporteres ud gennem cellekernens membran, og ud i cellens cytoplasma, binder der sig små ribosompartikler til dette mRNA, og mens ribosompartiklerne vandrer hen langs mRNA-strengen vokser der en proteinkæde frem, dannet ved "translation", idet mRNA-koden afgør, hvor hver enkelt aminosyreenhed skal placeres i det nydannede proteinmolekyle (som først kaldes et peptid og som – eventuelt samlet med andre peptidkæder – udgør et færdigt proteinmolekyle).

Hvordan blev Petuniablomsten hvid?

Petuniablomstens gen for violet farve inaktiveredes ved, at RNA'et ødelægdes, inden det nåede at blive afkodet til dannelse af et protein.

Hvordan virker RNAi i rundorme?

Det er den samme mekaniske hos rundorme som i Petuniaplanten: De små RNA-stumper, som blev undersøgt af Andrew Fire, pirrer cellen til at nedbryde de mRNA-molekyler, som har samme sekvens­kode, som RNA-stumperne selv. Da nedbrydningen sker før mRNA er blevet aflæst under dannelse af en proteinkæde, ser det ud, som om det er selve genet, der er inaktivt.

Hvor stor er interessen for RNAi?

Offentliggørelsen af opdagelsen af RNAi-forklaringen (i rundormeforsøget) fik forskningen på området til at eksplodere. På et år steg antallet af videnskabelige artikler om emnet fra et hundrede til over tusinde titler. I Nature skrev man, at opdagelsen kan "revolutionere virusforskning hos pattedyr" og "give helt nye behandlingsmetoder mod virus(kilde:3073). Opdagelsen af, hvordan naturen inaktiverer gener, blev kaldt det største medicinske gennembrud i årtier – af betydning på linie med opdagelsen af penicillin – en revolution inden for cellebiologi – og snart måske også en revolution inden for kræftbehandling.

Hvilken medicinsk betydning kan RNAi-opdagelsen få?

Lægemidler fungerer ofte ved (på indirekte måde) at stoppe aflæsning af cellens gener. Når det gælder kræft, kendes en lang række gener, som virker fremmende eller hæmmende på kræftudvikling. Gener, som medvirker til kræftudvikling, kaldes "onkogener". Lægerne ville gerne kunne lukke for oncogener i kræftsvulsters celler. Med opdagelsen opstod ideen om at udnytte RNAi-teknikken – dvs. om at konstruere dobbeltstrengede RNAi-stykker, hvor den ene streng er lig med et område af et bestemt gen i cellen, idet dette RNAi ifølge teorien burde kunne standse oversættelsen af mRNA, som svarer til genet. Det ville stoppe dannelsen af proteinet, som normalt ville blive dannet ud fra mRNA-sekvensen. RNAi-teknikken fungerer i praksis som forventet. RNAi-teknikken kan tænkes anvendt mod inflammationstilstande og autoimmune sygdomme, bl.a. mod gigt, for det er proteiner, som skaber inflammation, og ved at blokere disse proteiners dannelse vil sygdomme som f.eks. gigt kunne lindres. Virusinfektioner er baseret på dannelse af bestemte proteiner ud fra virusgener, og et stop for dannelsen af virusproteinerne vil medføre effektiv virusbekæmpelse. RNAi-teknikken kan også blive det vigtigste værktøj til bioteknologisk forskning – man kender talrige ­gener, men ofte ikke deres funktion, og det bliver nu lettere at studere, når enkeltgeners akti­vitet, dvs. at genets kode bliver udnyttet til dannelse af dets tilsvarende protein, kan stoppes. Et enormt potentiale åbner sig, når man kan slukke for udvalgte enkeltgener.

Hvad er det særlige ved RNAi?

Hidtil er mRNA blevet anset for et lidt kedeligt molekyle, som blot var transportbånd for gen-information fra cellens kerne til dens cytoplasma, hvor proteindannelsen sker. mRNA er kun en simpel, enkeltstrenget kopi af DNA med en anden sukkergruppe og hvor én af nukleotidbaserne er udskiftet med en anden type. Men RNA gemte på noget. Hemmeligheden er nogle små dobbeltstrengede RNA-molekyler. Det er dette dobbeltstrengede RNA (dsRNA), som er grus i oversættelsen af genetisk information fra DNA til protein. De små stykker kaldes "interferens-RNA" (forkortet: RNAi, idet betegnelsen "iRNA" kan ikke bruges, da det giver for mange irrelevante fund i Google). Det er specielt de meget små stykker interferens-RNA, som giver cellen besked på at ødelægge alt RNA med den tilsvarende sekvens – både dobbeltstrenget og enkeltstrenget RNA. (Da mRNA er dannet ud fra koden i DNA, vil RNA-sekvensen som kode betragtet også genfindes i DNA'et, men dette ødelægges ikke).

Der RNAi et naturligt virusforsvar?

Ja, dobbeltstrenget RNA består af to komplementære strenge, og hvis dobbeltstrenget RNA kommer ind i cellen, bliver det hurtigt klippet i små­stumper. Cellen opfatter det som fremmed og farligt. Cellen tror, at det er et virus, hvilket dobbeltstrenget RNA faktisk kan være. Virus, som danner dobbeltstrenget RNA, kan kun eksi­stere ved hjælp af metoder til at undgå cellens forsvar. RNAi mod virus Man har i laboratorieforsøg påvist, at RNAi-molekylerne kan bruges mod HIV og andre virus. En celle, som har RNAi-beredskab mod HIV-virusprotei­ner kan ikke inficeres af HIV. Hvis cellen er HIV-smittet, vil indførsel af RNAi-stumper forhindre virussets videre forme­ring. Forsøg har vist, at RNAi kan hæmme poliovirus samt virus, som giver livmoderhals-kræft. Hepatitis C virus, der menes at have ramt over 270 mill. mennesker verden over, er en enkeltstrenget RNA-virus, som både fungerer som mRNA og som virussets arvemateriale. RNAi-forsvar mod dette virus reducerer aktiviteten af virusgenerne til under 10%, skriver forskerne. I et forsøg med dyrkede, inficerede menneskeceller, sås virkningen mindre end 72 timer efter indførelsen af RNAi, og effekten sås stadig 3 uger senere. Forskerne konklu­derede, at RNAi vil kunne bruges mod hepatitis-C infektion(3070), og (ifølge andre forsøg) mod Moloney leukæmivirus (3071) og lentivirus(3071).

Kan anvendelse af RNAi blive vanskeligt i praksis?

Ja, de nævnte forsøg er alle laboratorieforsøg, og praktisk anvendelse kan blive vanskeligere. Man kan forestille sig flere problemer, f.eks. følgende: 1) Måske vil RNAi aldrig nå til det sted i kroppen, hvor det har effekt – eller ikke nå frem til de nødvendige steder i kroppen. 2) Måske er høj koncentration af RNAi giftigt i blodet. 3) Måske vil RNAi aktivere immunsystemet på uheldig måde. 4) Måske vil RNAi blive nedbrudt, før det når sit mål – således at der må findes måder at sammenkoble RNAi-molekylerne med andre stoffer, der kan beskytte og transpor­tere det. Måske vil små ændringer i RNAi kunne føre til kræft.

Har man tidligere forsøgt at bremse proteindannelsen på RNA-stadiet?

Ja, man har tidligere forsøgt at afbryde geners funktion ved at inaktivere RNA'et. Det er sket ved den antisense-teknik, hvor syntetiske DNA- eller RNA-enkeltstrenge bliver bundet til udvalgte mRNA, som derved inaktiveres før proteindannelsen. Antisense-teknikken viste sig vanskelig at udnytte, men RNAi-teknikken er anderledes, fordi det er en naturlig proces. Alle organismens celler bruger metoden fra naturens hånd, ja faktisk forstærker cellerne selv RNAi-signalet, idet cellen laver utallige nye kopier af det dobbeltstrengede RNAi. R NAi-teknikken kan være hundrede eller tusinde gange mere effektiv end antisense-teknik!

Hvilken rolle spiller RNAi i planter?

I planter synes RNAi at udgøre et immunsystem, som bekæmper virus og skadeligt DNA. I planter er RNAi også involveret i at guide vækstvæv (meristemvæv), som er plantens stamceller.

Hvilken rolle spiller RNAi i pattedyr?

Måske er RNAi også involveret i at hjælpe pattedyrs stamceller under disses udvikling til andre væv. RNAi er måske et naturmiddel til at manipulere og styre stamceller. Det betyder så også, at små ændringer i RNAi måske kan føre til kræft.

Kan RNAi bruges til at kortlægge geners funktion?

Ja, alle gener i rundormen Caenorhabditis elegans blev kortlagt i 1998, men genernes funktion forblev ­ukendt, men nu studeres de enkelte geners funktion med RNAi-teknik, og i 2004 var alle gener i 2 af ormens kromosomer blevet slukket ét ad gangen for at studere deres virkning. Ormene fodres med bakterier, som danner et bestemt RNAi-molekyle, hvorved RNAi-molekylerne bliver spredt til ormens forskellige celler, ja selv til kønsorganerne. Det optagne RNAi slukker det gen, som det er rettet imod. Resultatet ses som en ændring i ormens fysiologi, adfærd, udvikling osv.

Metoden anvendes også til at studere andre celler, idet man blokerer for enkeltgeners akti­vitet og ser virkningen på cellerne – f.eks. ved studier af bananfluer, gåsemadplanter, zebrafisk, kolibakterier og Neurospora-svampe.

RNAi-teknikken bruges også til at lukke for genaktiviteten i dyrkede menneskeceller.

Hvordan lukker RNAi for geners funktion?

Små RNAi-stumper på kun 21-23 nukleotid-enheder (såkaldte siRNA) dannes naturligt ved opklipning af større RNAi-molekyler. Opklipningen sker ved hjælp af et enzym, som kaldes "Dicer". Også mRNA-molekylerne klippes i stumper på 21-23 nukleotidenheder, og mister derved deres funktion som skabelon for proteindannelsen. I denne lille størrelse kan RNAi virke blokerende i bananflueceller og i pattedyrceller uden at aktivere disse cellers særlige forsvar mod RNAi. Det er vigtigt, fordi pattedyrceller har et særligt forsvar ("interferon-­responset"), som træder i kraft, når RNAi-stykkerne har over 30 basepar. Meget små RNA-stumper (mikroRNA eller miRNA) ser ud til at udøve endnu større kontrol over gen­aktiviteten.

Har RNAi en daglig funktion i cellen?

ja, som hjælp med at destruere mRNA. mRNA er et flygtigt molekyle i cellen, fordi det hurtigt nedbrydes af cellens enzymer og cellen har et mobilt destruktions­anlæg for dette RNA – idet RNAi-stumperne i cellen virker som en førerhund, der viser hen til mRNA, som skal destrueres: Små stumper af siRNA på 21-23 enheder kobles i cellen sammen med forskellige proteiner, som har enzymaktivitet (som endonuklease og helicase). Dette enzym-RNA-kompleks kaldes RISC (på engelsk: RNA-induced Silencing Complex). Det udgør det mobile destruktions­anlæg: I RISC-komplekset opsnoes det dobbeltstrengede, snoede siRNA. Sekvensen fra den ene siRNA-streng, som har antisensevirkning mod mRNA, bruges til at lokalisere dette mRNA i cellen og nedbryde det ved hjælp af RISC-enzymerne(ref.3, 3073). Til pattedyr kan man alternativt anvende særlige "små hårnåle-RNA" ("small hairpin", shRNA). Derved kan man opnå en blivende hæmning af et gen. Derved kan måske fremstilles transgene pattedyr og nye medicinske anvendelser kan måske opnås. Man kan også få vedvarende hæmning ved at et gen på bringes til at producere siRNA hele tiden.

Hvad er epigenetics? Har RNAi en funktion her?

"Epigenetics" kalder man det fænomen, som man har undret sig over, nemlig at det genetiske fænomen, at "genekspression" (genets oversættelse til protein) kan ændres på en måde, sådan at ændringen fortsætter i næste generation, men uden at der er tale om ændringer i DNA-koden. Fænomenet kaldes "epigenetics". Forklaringen kan være, at kromosomerne bliver enten mindre eller mere kompakte, hvorved aktiviteten af visse gener ændres. Årsagen kan være RNAi, idet RNAi har stor indflydelse på formen af kromatinet, dvs. det [DNA+protein]-materiale, som kromosomer består af. Hvis gærceller gøres ude af stand til at lave RNAi, kan de ikke danne det tætte "heterokromatin", som opstår omkring den såkaldte centro­mer under en celle­deling, og som udgør kromosomernes slanke "talje". RNAi-molekylerne er altså nødvendig for korrekt celledeling! Det tætte "heterokromatin" har kun meget lidt genaktivitet, og RNAi-molekylerne synes i det hele taget at kunne begrænse akti-viteten af gener.

Hvad er "hoppende gener"? Har RNAi en funktion her?

Hoppende gener, er DNA-områder, som kan flytte plads i genomet, dvs. som kan indsætte sig på flere steder, f.eks. midt i et stykke DNA, som fungerer som et gen, og som dermed kan komme til at ødelægge geners funktion ved at hoppe midt ind i genet. Måske udvikledes RNAi som et modtræk mod de hoppende gener, og måske udvikledes RNAi meget tidligt i evolutionen for at beskytte genomet mod ustabilitet.

Har RNAi en funktion under fosterudviklingen?

Fosterets RNAi Der er tegn på, at RNAi-stumperne bruges af biologiske organismer under deres udvikling. Under en organismes udvikling vil mange celler skulle gå til grunde for at give plads til andre celletyper. Her kan RNAi spille en rolle.

Har RNAi en funktion ved arvelige sygdommme?

Måske har RNAi noget at gøre med den arvelige sygdom "fragile X syndrom". Denne sygdom anses for at være den hyppigste mentale sygdom med arvelig baggrund, og 1 ud af 4000 mænd og 1 ud af 8000 kvinder rammes. Defekten skyldes manglende funktion hos et gen, som på engelsk kaldes for "fragile X mental retardation 1 gene (FMR1)". FMRP-proteinet, som genet koder for, er nødvendig for den tidlige udvikling af nervesystemet. FMRP-proteinet arbejder sammen med RNAi, enzymkomplekset RISC og Dicer-enzymet, som klipper dobbeltstrenget RNA til små stykker. Det tyder på, at hvis cellens RNAi-system er defekt opstår sygdomme og arvelige defekter.

Er RNAi kommet i kommerciel anvendelse?

Ja, nogle firmaer er begyndt at udvikle lægemidler under anvendelse af den nye RNAi-teknik. Et lille nyt tysk firma, Cenix Bioscience, blev etableret til formålet, og afprøver nu metoden på mus i kræftforsøg. Umiddelbart er der ikke konstateret toxiske virkninger, og firmaets direktør Christoph Echeverri kalder RNAi-teknikken ekstremt lovende.

Firmaet Qiagen har markedsført et testsæt, som på grundlag af RNAi-teknik kan afprøve 5000 forskellige stoffer samtidig.

Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dharmacon og AH diagnostics er eksempler på andre firmaer, der arbejder med RNAi.

Internetkilder:

**3073**

**3070**

**3071**

**3069**

**Kilde iøvrigt: www.rnai.net**

**Flere kilder om RNAi-teknologien**

(Hvis en kilde ikke findes: Spørg her)

Ud over de med nummer anførte kilder (som er nævnt her ovenfor og i BioNyt nr.128) blev der ved udarbejdelsen anvendt følgende kilder:
Ref.1: Biotech Denmark nov.2002 s.14-15 (Lone Frank). Artiklen bygger på interviews med Peter Arctander, prof. KU, afd. f. evolutionsbiologi; Peter E. Nielsen, prof. KU, inst. f. medicinsk biokemi & genetik, samt forskningschef i Pantheco A/S; Daniel Jeffares, post. doc. på KU, afd. f. evolutionsbiologi; Finn Cilius Nielsen, overlæge i klinisk biokemi, Rigshospitalet; og Christoph Echeverri, direktør i Cenix Bioscience.
Ref.2. Science bd.298 20dec2002 s.2296-97
Ref.3 BioZoom nr.4 2002 s. 30-33 (Rikke Møller, Ole Hørning, Nils J. Færgeman, Inst.f.Biokemi og Molekylær Biologi, SDU, nils.f@bmb.sdu.dk).
Ref.4: Nature bd. 391, s.806-11, 1998 (A.Fire m.fl.). “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”.

BioNyt nr.125 side 12-17 (Billederne ikke medtaget her).
RNAi-teknologien: Årtiers største forskningsgennembrud Knockout af mRNA
Opdagelsen af hvordan naturen inaktiverer gener på RNA-niveau

Det er blevet kaldt det største gennembrud i den medicinske forskning i årtier, og så var det nogle planteforskere, der nær mest snublede over det, da de ville gøre en violet petuniablomst endnu mørkere. I stedet for blev den hvid! Planteforskerne havde ved et tilfælde opdaget, hvordan naturen på sin egen måde lukker for et gen. I dette tilfælde det gen, der gør petu niaer violette.

En revolution
I dag er man klar over, at opdagelsen indvarsler en revolution i behandlingen af virussygdomme, sygdomme som vi ellers ofte står mag tesløse over for. Den nye metode gør det også muligt at studere geners aktivitet. Dette kan få stor betydning, da virkningen af ca. 85% af menneskets gener stadig er ukendt, selv om DNAsekvensen er kendt (3077). Forskerne på University of Arizona kendte et gen, som gør en Petuniaplantes kronblade mere violette. Man troede derfor naturligvis, at blomsten ville blive mørkviolet, hvis man indsprøjtede ekstra kopier af dette gen i planten. Resultatet var som sagt, at blomsterne i stedet blev helt hvide. Artiklen med beskrivelsen af dette forsøg udkom i 1990, og først 8 år senere fik man en forklaring. Umiddelbart kunne forskerne konstatere, at genet for violet farve var blevet slået helt ud – og at også de indsatte ekstra kopier af genet havde mistet deres effekt i planten. Violetgenet var blevet inaktiveret – men hvordan? Genet selv, dvs. det DNA som det var opbygget af, var der ikke noget i vejen med. Det var kun genets proteindannende egenskab, som var bremset. Man kunne altså indsætte et ekstra gen, og risikere at den oprindelige kopi blev inaktivt. Alt var mystik, tilsyne ladende. Senere samme år opdagede andre forskere samme fænomen i andre planter, Man fandt også samme mekanisme hos mikroorganismer. Det kunne tyde på, at fænomenet var universalt, – at det forekom i alle organismer. Senere viste det sig da også, at celler hos pattedyr og mennesker også kunne lukke deres geners funktion på denne måde. (Når det gælder basale fænomener er der ikke langt fra en menneskecelle til en plante- eller bakteriecelle!).

En forklaring
Der gik mange år, inden der kom en forklaring. Det skete først i 1998, hvor Andrew Fire fra Johns Hopkins University i Baltimore arbejdede med en rundorm. Han opdagede, at optagelse af små dobbeltstrengede RNA-stumper stopper for produktion af det protein, som kan dannes ud fra en gens kode. (Et gen virker som kode for dannelsen af et protein. Men genets kode oversættes ikke direkte til protein – det sker via en arbejdskopi af genet, som kaldes meddeler-RNA (mRNA). Gener er opbygget af DNA. Kodeaflæsningen sker altså sådan: DNA¨mRNA¨protein. Petunia blomstens violet-gen inaktiveres ved at mRNA’et ødelægges inden det når at blive afkodet til dannelse af et protein).

De små RNA-stumper, som Andrew Fire studerede, pirrer cellen til at nedbryde de mRNA-molekyler, som har samme sekvensopbygning, som RNA-stumperne selv. Da nedbrydningen sker før mRNA er blevet afl æst til dannelse af en proteinkæde, ser det ud som om genet er blevet inaktivt.

Største medicinske gennembrud i årtier
Offentliggørelsen af denne opdagelse fi k forskningen på området til at eksplodere. På et år steg antallet af videnskabelige artikler om emnet fra et hundrede stykker til over tusinde titler. For nylig skrev forskere i Nature, at det kan »revolutionere virusforskningen hos pattedyr« og give nye behandlingsmetoder mod virus(3073). Opdagelsen af, hvordan naturen inaktiverer gener, blev kaldt det største medicinske gennembrud i årtier – af betydning på linie med opdagelsen af penicillin – en revolution inden for cellebiologi – og snart måske en revolution inden for kræftbehandling.

Lægemidler fungerer ofte ved indirekte at inaktive gener, og man kender desuden en lang række gener, som virker fremmende eller hæmmende på kræftudvikling. Gener, som medvirker til kræftudvikling, kaldes onkogener. Lægerne ville gerne kunne lukke for sådanne gener i kræftsvulsters celler.

Lad os igen repetere: Når et gen er aktivt (dvs. når dets kode afl æses), må der først dannes en kopi af genets DNA-streng. Kopien laves i form af et mRNA-molekyle. mRNA er altså cellens kopi af cellekerne-arvematerialets gener. mRNA bliver transporteret ud af cellekernen, og bliver ude i cellen brugt som kodemateriale under proteinkædens opbygning. mRNA er hidtil blevet anset for at være et lidt kedeligt molekyle, som blot var transportbånd for cellekernens gen-information til cellens cytoplasma, hvor proteindannelsen altså sker. mRNA er faktisk blot en simpel kopi af DNA, men mRNA er enkeltstrenget, hvorimod DNA er dobbeltstrenget.

Hemmeligheden bag den nye teknik er små dobbeltstrengede RNA-molekyler. Dobbeltstrenget-RNA (dsRNA) er grus i oversættelsesmekanismen af genetisk information. De små RNAi-stykker giver cellen besked på at ødelægge alt RNA, som har den pågældende sekvens – både det dobbeltstrengede og det enkeltstrengede! (Da mRNA er dannet ud fra koden i DNA, vil sekvenskoden naturligvis også kunne genfi ndes i DNA’et, men dette ødelægges ikke).

Dermed op stod ideen om RNAiteknikken. Man burde derved kunne kon struere dobbeltstrengede RNAi-stykker, hvor den ene streng er lig med et område af et bestemt gen i cellen. Dette RNAi skulle så kunne standse oversættelsen af det mRNA, som svarer til genet. Dermed ville man kunne stoppe dannelsen af det protein, som normalt ville blive dannet på grundlag af mRNA-sekvensen.

Det viste sig, at RNAi-teknikken fungerer i praksis som man forventede. RNAi-teknikken vil kunne bruges mod infl ammationstilstande og autoimmune sygdomme, bl.a. mod gigt. Det er proteiner, som skaber infl ammation, og ved at blokere for disse proteiners dannelse vil sygdomme som f.eks. gigt kunne lindres eller undgås.

Ny virusforskning
Virusinfektioner er svære at bekæmpe, men da de er baseret på dannelse af bestemte proteiner ud fra virusgener, vil et stop for dannelsen af virusproteinerne være lig med en effektiv virusbekæmpelse.

Ud over disse anvendelsesmuligheder vil RNAi-teknik kunne blive fremtidens vigtigste værktøj til at udføre bioteknologi. Man kender i dag talrige gener, men ofte ikke disse geners funktion. Det ville blive lettere at studere dette, hvis man kunne slukke for enkeltgeners aktivitet, dvs. forhindre at genets kode bliver udnyttet til dannelse af dets tilsvarende protein.

Den nye teknik kaldes RNAinterferens (»RNAi«) eller »naturens egen måde at lukke gener på«. Et enormt potentiale åbner sig, når man kan lukke og slukke for udvalg te gener.

Dobbeltstrenget RNA består af to komplementære strenge, ligesom man ser hos DNA. Hvis dobbeltstrenget RNA kommer ind i cellen bliver det hurtigt klippet i små stumper. Cellen opfatter det som fremmed og farligt. Cellen tror, at det er et virus, hvilket dobbeltstrenget RNA undertiden faktisk kan være. Vira, som danner dobbeltstrenget RNA, kan kun eksistere, fordi de har fundet på metoder til at undgå cellens forsvar.

De små stykker dobbeltstrenget RNA fi nder sammen med et særligt proteinkompleks, som regulerer aktiviteten af det gen, som genkendes af RNAi-stumperne.

Virussets RNA bliver inaktiveret af siRNA (små interferens-RNA molekyler)

Middel mod HIV?
Man har i laboratorieforsøg vist, at RNAi-molekylerne kan bruges som våben mod HIV-virus og andre virus. Det viser sig, at hvis en celle på forhånd har et RNAiberedskab mod HIV-proteiner, kan cellen ikke infi ceres af HIV-virusset – fordi virusproteinerne ikke kan dannes. Og hvis cellen allerede er HIV-smittet, vil indførsel af RNAi-stumper forhindre virussets formering og spredning til andre celler. På samme måde har man eksperimentelt vist, at RNAi kan hæmme poliovirus samt virus, som giver livmoderhals-kræft.

Hepatitis C virus, der menes at have ramt over 270 millioner mennesker verden over, er et enkeltstrenget RNA-virus, som både fungerer som proteinkodende mRNA og som virussets arvemateriale. RNAimolekyler mod dette virus reducerer »dramatisk« aktiviteten af virusgenerne til under 10%, skriver forskere. Man benyttede i forsøget dyrkede, infi cerede menneskeceller, og virkningen begyndte inden der var gået 72 timer efter indførelsen af RNAi, og effekten var stadig til stede 3 uger senere. Forskerne til dette forsøg konkluderede, at RNAi vil kunne bruges til behandling af hepatitis-C infektion(3070). Andre forsøg har vist, at RNAi kan bruges mod f.eks. Moloney leukemia virus og lentivirus (3071).

Et er teori – noget andet er praksis
Dette er altsammen kun laboratorieforsøg. Anvendelse i praksis kan være vanskeligere. Måske vil RNAi aldrig nå hen til det sted i kroppen, hvor det vil have en effekt – eller måske vil det ikke nå ud til alle de nødvendige steder i kroppen. Måske er høj koncentration af RNAi giftigt i blodet. Måske vil det aktivere immunsystemet på uheldig måde. Måske vil det blive nedbrudt før det når sit mål – således at man må fi nde på måder til at sammenkoble RNAimolekylerne med andre stoffer, der kan virke beskyttende og transporterende.

Selv om man har forhåbninger om anvendelse af RNAi mod HIVvirus, kan der være vanskeligheder. F.eks. kan HIV-virus gemme sig i rum i cellen (bl.a. MHC-II compartments og vesikler). Her vil virusset være beskyttet og utilgængeligt for RNAi-molekylerne i fl ere måneder.

Desuden vil HIV-virus hurtigt udvikle mutationer, som er resistente overfor individuelle siRNAstykker. Det har f.eks. allerede vist sig, at poliovirus kan undslippe et siRNA-knockout ved at mutere til nye virusformer. Men visse dele af HIV-genomet vil det være svært for virusset at ændre på, fordi det kun sjældent muterer, som følge af at mutationer disse steder vil skade virussets evne til infektion. RNAi mod disse steder på virusset vil derfor virke bedre.

Et samtidigt angreb, som foretages af fl ere siRNA-molekyler mod forskellige dele af virusgenomet vil gøre det sværere for virussets mutationsforsvar: Det ville nemlig kræve fl ere samtidige mutationer. I praksis har det dog vist sig vanskeligere end det lyder, fordi forskellige siRNA-stykker kan konkurrere med hinanden, f.eks. er der konkurrence mellem CD4- specifi k siRNA og CD8-specifi k siRNA(3077).

RNAi-teknikken kan under alle omstændigheder hjælpe forskerne til at få bedre forståelse af samspillet mellem HIV-virus og værten, og RNAi-teknikken kan vise nye målsteder i cellen, som kan bruges i virusbekæmpelse.

En naturlig teknik
Organismens celler er fra naturens hånd indrettet til at udføre RNAiteknik, ja faktisk forstærker cellerne RNAi-signalet, idet cellen selv fabrikerer en masse nye kopier af det dobbeltstrengede RNAi. Laboratorieforsøg har vist, at RNAi-teknikken derfor kan være hundrede eller tusinde gange mere effektiv end antisense-teknikken. I planter synes RNAi at udgøre et immunsystem, som bekæmper virus og skadeligt DNA. I planter er RNAi også involveret i at guide vækst væv (meristemer), hvilket er plantens stamcellevæv. Derfor er RNAi måske tilsvarende involveret i at hjælpe pattedyrs stamceller medens de udvikler sig til andre væv. RNAi er måske et vigtigt middel til at manipulere og styre stamceller. Men det betyder også at små ændringer i RNAi måske kan føre til kræft.

Påvisning af geners funktioner
Alle 19.099 gener i rundormen Caenorhabditis elegans blev som det første dyr påvist ud fra den færdige kortlægning i 1998 af de 96.893.008 basepar i ormens DNA (menneskets DNA er 30 gange større), men genernes funktion forblev ukendt.

Nu er man imidlertid begyndt at studere de enkelte geners funktion: Man er i dag nået så langt, at alle generne i 2 ud af ormens 6 par kromosomer er blevet slukket ét ad gangen for at studere virkningen. Ormen bliver fodret med kolibakterier, som er i stand til at danne et bestemt RNAi-molekyle. Når ormen har ædt dette RNAi bliver det spredt til ormens forskellige celler, ja selv til gonaderne, og her slukker RNAi for det gen, som det er rettet imod. Resultatet ses som en ændring i ormens fysiologi, adfærd, udvikling osv.

Samme metode bliver nu an vendt til at studere andre celler i laboratorieforsøg: Man blokerer for enkeltgeners aktivitet og studerer virkningen på cellerne. Metoden anvendes i stadig fl ere laboratorier til studier af bananfl uer, gåsemadplanter, zebrafi sk, kolibakterier og Neurospora-svampe. RNAi-teknikken bruges nu også til at lukke for humane cellers aktivitet i cellekulturer.

Det har vist sig, at små RNAistumper på kun 21-23 nukleotid-enheder (såkaldte siRNA) dannes naturligt ved opklipning af større RNAim o l e k y l e r . Opklipningen sker ved hjælp af et enzym, kaldet »Dicer«. mRNA-molekylerne klippes også i stumper på 21-23 nukleotid-enheder, og mister derved deres funktion som kode og skabelon for proteindannelsen. I denne lille størrelse kan RNAi virke blokerende i bananfl ue-celler og i pattedyr-celler uden at aktivere disse cellers forsvar mod RNAi. Det er vigtigt, fordi pattedyrceller har et særligt forsvar (»gamma-interferon-responset«), som træder i kraft, når RNAi-stykkerne er på over 30 basepar.

Cellen har et mobilt destruktionsanlæg for RNA. Det er velkendt, at mRNA er et ustabilt molekyle i cellen, fordi det hurtigt nedbrydes af cellens enzymer. RNAi-stumperne virker i cellen som en førerhund, der viser hen til det mRNA, som skal destrueres: De små stumper af siRNA på 21-23 enheder kobles i cellen sammen med forskellige proteiner, som har enzymakti vitet (enzymerne endonuklease, og helicase). Dette enzymkompleks kaldes RISC (RNA-induced Silencing Complex). Det er dette, som udgør det mobile destruktionsanlæg: I RISC-komplekset opsnoes det dobbeltstrengede, snoede siRNA af helicase-enzym, hvorefter RISC-destruktionsanlægget benytter sekvensen fra den siRNAstreng, som har antisense-virkning mod mRNA, til at lokalisere dette mRNA i cellen og nedbryde det ved hjælp af ribonuklease-enzymer i RISC-komplekset (ref.3, ref.3073).

Specielt til pattedyr kan man alternativt anvende særlige »små hårnåle-RNA« (»small hairpin«, shRNA). Derved kan man opnå en blivende hæmningsvirkning på et gen. Dette kan tænkes anvendt til at fremstille transgene pattedyr og til udvikling af nye medicinske anvendelser. Man kan også opnå en vedvarende hæmning ved at få et gen til på kontinuerligt måde at producere siRNA.

Geners funktion kan studeres med andre metoder end RNAi, men de er mere besværlige, mindre effektive, mere tidsrøvende og dyrere. Man har tidligere forsøgt at afbryde geners funktion ved at inaktivere mRNA’et med den såkaldte antisense-teknik, hvor syntetiske DNAeller RNA-enkeltstrenge binder sig til udvalgte mRNA-analoger, som derved inaktiveres, således at proteindannelsen stoppes. Man troede meget på antisense-teknikken, men den viste sig vanskelig at udnytte. RNAi-teknikken er anderledes, fordi det er en naturlig proces.

Tidligere anvendte metoder er:
– »antisense-vektorer« RNA eller DNA, som komplementær-bindes til mRNA eller dets gen. Hårnåle-udgaver af RNA kan give mere varige hæmninger af proteinkodningen fra et gen

– »ribozymer« Enzymatiske RNA-molekyler, som spalter mRNA med komplementær-sekvens

– »aptamer-biblioteker« cDNA-som koder for korte peptide)

– »genetiske suppressor-elementer« cDNA-fragmenter, der indvirker på funktionen af et gen.

Funktionen af et gen hos mennesket kan ofte studeres i andre dyr, som har næsten samme gen. F.eks. er der i ormen Caenorhabditis elegans fundet 305 gener, som formindsker fedtdepoterne og 112 gener, som forøger fedtdepoterne. Nogle af disse gener har homologe partnere i andre pattedyr, hvor de også er involveret i fedtstofskiftet. Det viser at fedtstofskiftet er bevaret gennem evolutionen, og at ormen derfor kan bruges som en model for menneskets fedtstofskifte og stofskiftesygdomme. Det er iøvrigt interessant at visse fejl i stofskiftefunktionen og fejl i mitokondrierne hos ormen medførte længere (!) levetid (3077).

Ændret gén-udtryk uden at genet er blevet ændret
Man har undret sig over et genetisk fænomen, hvor ændringer i génudtryk (genekspression) forekommer over mindst én generation – uden at der er tale om ændringer i DNA-koden. Fænomenet kaldes »epigenetics« (ref.2). En forklaring på fænomenet kan være, at kromosomerne bliver mindre kampakte eller mere kompakte, hvorved aktiviteten af visse gener ændres. Årsagen kan være RNAi, idet RNAi har stor indfl ydelse på formen af kromatinet, – dvs. det DNA+protein materiale, som kromosomerne er opbygget af. Hvis gærceller gøres ude af stand til at lave RNAi, kan de ikke danne det tætte såkaldte »heterokromatin«, som opstår omkring centromeren under en celledeling, og som udgør kromosomernes slanke »talje«. RNAi-molekylerne er derfor nødvendige for korrekt celledeling.

Det tætte »heterokromatin« har meget lidt genaktivitet, og RNAimolekylerne synes i det hele taget at kunne begrænse genaktiviteten.

Udvikledes RNAi som beskyttelse mod hoppende gener ?
Hoppende gener, dvs. DNAområder, som kan fl ytte mellem fl ere destinationer, kan ødelægge geners funktion ved at hoppe midt ind i et gen. Måske udvikledes RNAi som et modtræk hertil (ref.2). RNAi udvikledes måske allerede meget tidligt i evolutionen for at beskytte genomet mod ustabilitet.

RNAi – betydning for fosterudviklingen
Der er tegn på, at RNAi-stumperne måske bruges af biologiske organismer under deres udvikling. Under en organismes udvikling vil mange celler skulle gå til grunde for at give plads til andre celletyper. Her kan RNAi måske spille en rolle (ref.2).

Sygdommen »fragile X syndrom« har måske noget med RNAi at gøre (3069). Sygdommen er den hyppigste mentale sygdom med arvelig baggrund, og rammer 1 ud af 4000 mænd og 1 ud af 8000 kvinder. Defekten skyldes manglende funktion hos et gen, som kaldes »fragile X mental retardation 1 gene (FMR1)«. Det FMRP-protein, som genet koder for, er nødvendig for den tidlige udvikling af nervesystemet. FMRP-proteinet synes at arbejde sammen med RNAi, enzymkomplekset RISC og det såkaldte Dicer-enzym, som klipper dobbeltstrenget RNA i små stykker. Det kan tyde på, at defekter i RNAisystemet i cellen kan medføre sygdomme og arvelige defekter.

Industrielt brug af RNAi
Nogle fi rmaer er begyndt at udvikle lægemidler på grundlag af RNAi-teknikken. Det gælder f.eks. et lille nyt tysk fi rma, Cenix Bioscience, der blev etableret til formålet. Firmaet afprøver metoden i kræftforsøg på mus, og har umiddelbart ikke konstateret toxiske virkninger. Ifølge fi rmaets direktør Christoph Echeverri fra fi rmaet er RNAi-teknikken ekstremt lovende.

Firmaet Qiagen har markedsført et testsæt, som på grundlag af RNAi-teknik kan afprøve 5000 forskellige stoffer samtidig. Firmaet markedsførte i 2003 et siRNA-testsæt, der var specifi k for SARScoronavirus, samt indledte kliniske forsøg med et lægemiddel mod SARS (mod virussets protease-enzym). Desuden har fi rmaet indgået en aftale med Novartis om at syntetisere et siRNA-bibliotek for hele menneskets genom.

Også siRNA’ets sense-streng kan undertiden virke inaktiverende på mRNA, og fi rmaet Dharmacon har udviklet en metode, så kun antisense-strengen virker, hvorimod sense-strengen blokeres (ref.6).

Ref.1: Biotech Denmark nov.2002 s.14-15 (Lone Frank). Artiklen bygger på interviews med Peter Arctander, prof. KU, afd. f. evolutionsbiologi; Peter E. Nielsen, prof. KU, inst. f. medicinsk biokemi & genetik, samt forskningschef i Pantheco A/S; Daniel Jeffares, post. doc. på KU, afd. f. evolutionsbiologi; Finn Cilius Nielsen, overlæge i klinisk biokemi, Rigshospitalet; og Christoph Echeverri, direktør i Cenix Bioscience.

Ref.2. Science bd.298 20. dec2002 s.2296- 97.

Ref.3 BioZoom nr.4 2002 s. 30-33 (Rikke Møller, Ole Hørning, Nils J. Færgeman, Inst.f.Biokemi og Molekylær Biologi, SDU, nils.f@bmb.sdu.dk).

Ref.4: Nature bd. 391, s.806-11, 1998 (A.Fire m.fl .). »Potent and specifi c genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans«.

Ref.5 Nature Reviews, dec. 2003 “RNAi collection”.

Ref.6: http: www.dharmacon.com.

Kilde iøvrigt: www.rnai.net.

RNAi-revolutionen lover:
Virustest og -behandling
Middel mod HIV-virus.
Nye lægemidler.
Kræftbehandling.
Transgene dyr.
Gen-funktion kendskab.//

Tegn abonnement på

BioNyt Videnskabens Verden (www.bionyt.dk) er Danmarks ældste populærvidenskabelige tidsskrift for naturvidenskab. Det er det eneste blad af sin art i Danmark, som er helliget international forskning inden for livsvidenskaberne.

Bladet bringer aktuelle, spændende forskningsnyheder inden for biologi, medicin og andre naturvidenskabelige områder som f.eks. klimaændringer, nanoteknologi, partikelfysik, astronomi, seksualitet, biologiske våben, ecstasy, evolutionsbiologi, kloning, fedme, søvnforskning, muligheden for liv på mars, influenzaepidemier, livets opståen osv.

Artiklerne roses for at gøre vanskeligt stof forståeligt, uden at den videnskabelige holdbarhed tabes.