Denne side er et supplement til
**BioNyt – Videnskabens Verden** nr.158

Du kan tegne abonnement på BioNyt: Videnskabens verden **her!**

Køb dette nr.

SPØRGSMÅL OG SVAR OM RCA-TEKNOLOGI:

Dele af denne side kræver abonnement

på BioNyt Videnskabens Verden

SPØRGSMÅL OG SVAR OM RCA-teknologien Supplement til BioNyt Videnskabens Verden nr. 158

Læs hele artiklen om RCA i BioNyt Videnskabens verden, nr.158

Hvad er RCA-teknologien?

RCA-teknologien betegnes som PCR-teknologiens afløser. PCR-metoden kræver at temperaturen styres og hele tiden veksler mellem 95°C / 55°C / 72°C. Det kan ganske vist automatiseres, men kræver laboratorieudstyr, og RNA-metoderne har ikke dette krav.

RCA-metodens opdagelse RCA-metoden blev opfundet i begyndelsen af 1990’erne. I første omgang var det en ny metode til opformering af DNA og forstærkning af signalet til bl.a. diagnoser (ref.10703). Metoden opformerer DNA'et ved at lade et DNA-polymerase-enzym aflæse cirkulært DNA igen og igen under nydannelse af DNA undervejs. Fordele ved RCA-metoden RCA-metoden har et helt afgørende træk: Den kan foregå ved omgivelsestemperatur (isotermisk). Dette muliggør analyse uden opvarmning – og kan dermed udføres uden elektricitet(ref.10703). Det giver RCA-metoden et stort potentiale på steder i verden uden elektricitet (ref.10705).

Hvad er fordelene ved RCA-teknologien?

RCA-teknologien er (sammenlignet med PCR) mere enkel at udføre, meget følsom og specifik og kan påvise ikke blot DNA og RNA (som PCR-metoden er begrænset til), men kan også påvise proteiner og andre biomarkører (ref.10708). I princippet kan der ved hjælp af RCA-metoden hurtigt og simpelt stilles en diagnose på mange livstruende sygdomme – blot med en lille blodprøve eller en lille spytprøve.

Hvad er mål-DNA?

RCA-metoden til opformering af DNA bygger på, at man på forhånd kender base­sekvensen for det stykke DNA ("mål-DNA'et", target-DNA), som man vil påvise og opformere til et signal-niveau, hvis det eventuelt findes i prøven.

Hvad er RCA-metodens hjælpeprobe?

En ringformet hjælpeprobe er ofte nødvendig i RCA-metoden. Der anvendes altså typisk en hjælpeprobe, der kan danne en DNA-ring. Hjælpeproben har i enderne DNA-områder, som er komplementære med mål-DNA'et.

Hvad er hybridiseringen i RCA-teknologien?

RCA-teknologien benytter sig af hybridisering, f.eks. mellem en ringformet hjælpe­probe og mål-DNA'et (target-DNA). Da hjælpeprobens ender er komplementære med mål-DNA'et, hybridiserer de til mål-DNA'et. Det sker, når hjælpeproben opdager mål-DNA'et. Derefter er det opgaven at gøre dette til et synligt signal.

Hvad er DNA-polymerasen i RNA-teknologien?

RCA-metoden medfører nydannelse af DNA, som er en kopi af mål-DNA'et. Til nydannelse af DNA kræves et DNA-polymerase-enzym (som navnet siger laver enzymet en ­polymer af DNA-molekyleenheder). DNA-polymerase-enzymet starter i enden på primeren, og nydanner derefter DNA, som er komplementært med den ringformede DNA-streng. DNA-polymerase-enzymet aflæser altså det ringformede DNA i omgang efter omgang, cirkel efter cirkel, rundt og rundt.

Hvad er RCA-primeren i RCA-teknologien?

DNA-polymeraseenzymet kræver en RCA-primer (et oligonukleotid af deoxyribonukleotider), som enzymet kan starte på. Polymeraseenzymet kan nemlig ikke starte sin DNA-syntese på enkeltstrenget DNA.

Hvis der kun er én type primer tilstede danner enzymet en lang tandem af forbundne kopier af det cirkulære DNA. Dvs. gentagne DNA-sekvensstykker, som perler på en snor. Aflæsningen af DNA-cirklen kommer til at ligne situationen, hvor man ruller en ledning af en tromle – blot med den forskel, at ”ledningen” dannes undervejs.

Under tilstedeværelse af de 4 deoxyribonukleotider, som er byggesten for DNA, ruller den ene kopi efter den anden af det cirkulære DNA, medens det allerede dannede DNA undervejs løsnes fra dobbelt-DNA-strengen. Produktet ruller af det cirkulære DNA, deraf navnet RCA, ”rolling circle amplification”, eller i korthed RCA-metoden.

Amplifikation betyder (signal)forstærkning. Signalet forstærkes, fordi der sker en opformering af DNA'et. En dansk oversættelse kunne være ”rullecirkel-forstærkning”, ”rullecirkel-opformering”, ”rullecirkel-amplifikation”, ”rotationscirkel-amplifikation” eller lignende).

Hvad er RCA-produktet?

RCA-produktetet er den opformering af DNA'et, som sker under RCA-teknologiens udførelse. Hvis DNA-polymerasen katalyserer syntese af det cirkelformede DNA f.eks. 1000 omgange, bliver der dannet 1000 delprodukter. Disse delprodukter har alle information om mål-DNA-sekvensen og signal­sekvensen.

Man lader ofte RCA-primeren være koblet til en fast overflade. Derved hænger hele tandem-sekvensen fast til denne overflade (immobilisering). På denne måde kan man synliggøre et enkelt mål-DNA i en vævsprøve, fordi det lange stykke af nydannet DNA hænger fast på den faste overflade, og her afgiver et signal.

Hjælpeproben kan indeholde en signal­sekvens, der senere kan bruges til at synliggøre slutproduktet. På DNA-polymerasens vej bliver denne hjælpeprobes signalsekvens aflæst.

Hver runde giver et delprodukt, som dels indeholder information om mål-DNA-sekvensen, dels signal-sekvensen.

Synliggørelse af den afrullede streng af kopi-DNA kan ske ved, at en af de fire deoxyribonukleotider var mærket med et fluorescerende molekyle.

Synliggørelsen kan også ske efter at overskydende reagens er vasket væk – nemlig ved at tilsætte fluorescensmærkede oligo­nukleotider, som hybridiserer med det nye DNA (dvs. binder sig specifikt hertil) (ref.10713).

Hvordan har udviklingen af RCA-teknologien været?

Vadim V. Demidov opsummerede i 2005, hvordan ti-året 1995-2005 var gået med hensyn til analyser inden for DNA-diagnostik (ref.10708). I 2005 var PCR stadig den dominerende analyse­metode ved DNA-diagnostik. Men PCR var ved at blive indhentet af de metoder, som ikke kræver opvarmning i løbet af analyseprocessen – og især RCA-metoden var blevet mere og mere populær. I 2005 arbejdede flere biotek-firmaer på at udvikle en kommerciel diagnoseanalyse baseret på RCA-princippet (ref.10708) (bl.a. Quiagen og Hamilton Thorne Biosciences fra USA, Amersham Biosciences fra UK, Olink Bioscience fra Sverige og Biokit fra Spanien). RCA-metoden er senere blevet modificeret på utallige måder (ref.10703). (ref.10705).

RCA-patenter Udviklingen af RCA blev hæmmet af patent­situationen (ref.10708). Patenter kan både fremme og hæmme udvik­lingen. Det første patent inden for et nyt felt er ofte formuleret meget bredt for at sætte sig på hele feltet. Al efterfølgende udvikling kommer i voldsom afhængighed af det første patent, og der betales licenser for kommerciel udnyttelse.

Den første patentansøgning havde J. I. Auerbach som opfinder og titlen ”Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules”. Den blev i 1994 til US-patent nr. 5.354.668 (ref.10708). I 1990’erne kom mange andre patentansøgninger. Situationen blev kompleks med gensidig afhængighed mellem de forskellige patenter (ref.10708). En sådan situation kan føre til store stridigheder om rettighederne.

Et patent giver kun en geografisk afgrænset ret. Et US-patent gælder således kun i USA. (Danmark kan være dækket af et nationalt patent eller af et europæisk "EP-patent").

Det kræver et stort arbejde at afklare, i hvilke lande der findes et gyldigt patent på en teknologi. Videreudvikling af RCA-test RCA-teknologien kan bruges sammen med mange forskellige målemetoder. Den omfattende udvikling af RCA-teknologien siden starten i 1990’erne opsummeres af danske forskere i en artikel med ikke mindre end 206 referencer (ref.10718).

RCA-metoden er blevet kombineret med meget avancerede målemetoder, men det mest spændende er nok, at RCA kan tilpasses til brug under meget lav-teknologiske forhold, og derfor kan finde anvendelse uden for de specialiserede laboratorier, – altså f.eks. hos den praktiserende læge eller endog af den enkelte patient (ref.10718).

Når man kan måle markører på en enkelt celle, bliver det muligt at måle på materiale, hvor ikke alle celler er ens. Dette er tilfældet ved kræft, hvor der på samme tid findes mange forskellige celletyper, nemlig dels de såkaldte kræft-stamceller og dels de mere eller mindre differentierede kræftceller. Det vides ikke, hvordan disse forskellige celler påvirker udviklingen af kræft og behandlingen af kræft.

Med de nye teknikker til påvisning af enkelt-molekyler i enkeltceller åbnes der altså op for nye forskningsområder (ref.10718).

Hvordan kan RCA-teknologi kombineres med minidråbe-teknologi? RCA kombineret med en teknologi, kaldet microfluidic nano-liter platform, åbner en helt ny verden Ved mange af de tidligere anvendelser af RCA-teknologien foregik reaktionen på en fast overflade, hvor produktet fra RCA forblev bundet til den faste fase og altså blev påvist her.

Denne opsætning med en fast overflade er imidlertid ikke anvendelig i alle tilfælde, så forskere er gået på jagt efter en metode, hvor et markørprotein kan måles på en enkelt celle – uden at cellen er bundet til en fast fase.

Der er tidligere blevet udviklet såkaldte microfluidic-metoder. Nu er det lykkedes forskere at få RCA-­reaktionen til at foregå inde i en dråbe af nanostørrelse (ref.10717). Kombinationen af de to teknikker muligør ultrafølsom analyse på enkeltceller.

Hvad er microfluidic-teknologien?

Grundprincippet i microfluidic-teknologien er at indeslutte en ­enkelt celle i en meget lille dråbe (af nanoliter-størrelse) med RCA-reagenser.

De meget små dråber dannes i mikrokanaler. Dråben omsluttes af olie. Når der skal opnås dråber med kun en enkelt celle, vil der også være mange dråber uden celler til stede (eller med mere end én celle), men det kompenseres der for ved at fremstille et meget stort antal dråber i det automatiserede apparatur (ref.10717).

Metoden er blevet anvendt til at måle en specifik tumor-markør EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Den lave forekomst af denne markør har hidtil gjort det vanskeligt at måle den.

Hvis RCA i minidråber kombineres med celle­sorteringsmetoder, vil det være muligt at isolere celler, der er positive for EpCAM, og dermed opnå en større mængde EpCAM-aktive celler til yderligere studier (ref.10717).

Minikugle-metode kombineret med RCA-metoden: I 2009 beskrev T. Konry og kollegaer en kombination af dels minikugle-analyser til at indfange de stoffer, der skal analyseres, og dels et RCA-baseret system til at opnå stærkt øget følsomhed af analysen (ref.10714).

Minikugler kan på overfladen bære monoklonale antistoffer til at indfange proteiner som f.eks. interleukin-8 (IL-8). Man bringer minikuglerne sammen med det protein, der skal bestemmes (i eksemplet her er proteinet altså interleukin-8). Med endnu et antistof får man interleukin-8 til at sidde i sandwich mellem de to antistoffer. Derefter udføres RCA-analyse til opformering af signalet. Trin A: En minikugle belagt med antistoffer mod f.eks. signalstoffet interleukin-8 indfanger dette stof. Trin B: Der sker en avidin/biotin-hjulpet binding til en indfangningsprobe, der ved hybridbinding er koblet til en hjælpeprobe. Det store molekyle avidin og det lille molekyle biotin bindes meget stærkt til hinanden. Til biokemiske analyser bruges denne avidin/biotin-binding meget ofte. Avidin kan binde sig til flere biotin-molekyler. Trin C: Hjælpeproben (også kaldet padlock probe, "låse-DNA-stykke") indfanger mål-DNA'et, fordi hjælpeproben har en sekvens, så hver ende hybridiserer til kendte områder i det DNA-målområde, der skal påvises. Trin D: Hjælpeproben bringer derved DNA-enderne sammen, så de kan lukkes med et enzym for at opnå en cirkeldannelse. Hullet lukkes af dette enzym, en DNA-ligase. Trin E: Der er nu tilvejebragt et grundlag for en RCA-amplifikation med det ringformede DNA som udgangspunkt (ref.10714). Trin F: Signalprober genkender og hybridiserer til dele af den dannede DNA-streng. Tilstedeværelsen af DNA-stykket er dermed bekræftet ud fra signalet fra signalproberne. F.eks. ved at hybridisere med fluorescensmærkede signalprober.

Med denne type analyse kunne man måle helt ned til 1 pM mål-DNA og 10 fM interleukin-8 i samme analyse (ref.10714)

Hvad er multiplekse analyser i RCA-teknologien?

Der stilles store forventninger til RCA i multiplekse analyser. RCA er indtil nu især blevet udviklet til at påvise nukleinsyrer (dvs. DNA og RNA), proteiner eller enzymaktiviteter. Men i fremtiden forventes det at blive muligt at videreudvikle RCA-teknologien til at måle forskellige molekyltyper og enzymaktiviteter i samme analyse (multiplekse analyser) (ref.10718).

Herved vil man kunne følge flere molekylære aktiviteter inde i en celle – selvom cellen befinder sig i et væv med andre celletyper (ref.10718).

Der kendes ikke andre analyse­metoder, hvormed der kan udføres så komplekse analyser (ref.10718). Analyse af enkeltceller i heterogent væv kan bruges inden for kræftforskningen.

Hvordan kan RCA-teknologien bruges til at påvise enzymaktiviteter?

RCA-teknologien kan bruges som en følsom metode til påvisning af enzym-aktivitet. Når man ønsker at måle små mængder af et genprodukt, har det været almindeligt at bruge en kvantitativ PCR-reaktion, fordi PCR-teknologien kan måle små mængder. Men PCR-teknologien er som tidligere nævnt en kompleks teknologi, og den måler kun oligonukleotider (f.eks. mRNA) og ikke enzymaktiviteter.

Ved hjælp af PCR-metoden kan man f.eks. måle den mængde mRNA, der koder for et enzym, men man er ikke i stand til at måle, om enzymet er i en aktiv, dvs. katalyserende, form.

I mange tilfælde er man netop mest interesseret i at måle selve enzym­aktiviteten.

På dette område har forskere ved Århus Universitet udført frontforskning (ref.10715). De har arbejdet med en metode til at måle aktiviteten af human topo­isomerase I. Måling af dette enzym er interessant i forhold til visse kræftbehandlinger. Kemoterapi med stoffer fra camptothecin-familien rammer dette enzym, så ved at måle aktiviteten af topoisomerase-I kan man finde ud af, hvor godt behandlingen med camptothecin virker.

Enzymet topoisomerase I klipper hul i den ene streng af dobbeltstrenget, ringformet DNA, således at for høj spænding i den dobbeltstrengede DNA-ring afhjælpes. Dette hul skal efterfølgende lukkes ved sammenføjning (ligering). Denne klip-og-sy-reaktion er meget vigtig for en celles liv, men omstændighederne varierer fra organisme til organisme.

Ved at anvende specifikke sekvenser i de hjælpe-prober, der anvendes under analysen, kan man påvise, om en celle har modtaget et fremmed enzym med en anden specificitet, f.eks. på grund af en infektion.

Malaria kan ved RCA-teknologien påvises i en simpel spytprøve. Cirkel-DNA metoden (RCA) er anvendt til test for malaria En dansk forskergruppe ved Århus Universitet har udviklet en RCA-­baseret test til påvisning af malariaparasitter i blod. Med RCA-metoden kunne de måle en bestemt enzym­aktivitet, som afslører malariaparasittens tilstedeværelse (ref.10705).

Forskerne ved Århus Universitet er de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection) (ref.10715)(ref.10705). RCA-test for malaria-version af enzymet topo-isomerase I De danske forskere målte specifikt på aktiviteten af et for malariaparasitten livsnødvendigt DNA-klippe-og-lime-enzym, topo­isomerase-I, i en blodprøve. Enzymet topoisomerase I, som påvises i testen, er et enzym, der findes hos alle levende organismer, idet det er helt ­essentielt for organismens overlevelse.

Topoisomerase I (ofte kaldet TopI) fremmer (ved katalytisk enzym­aktivitet), at der sker brud på den ene streng i dobbeltstrenget DNA, hvorved der dannes et covalent enzym/DNA-mellemprodukt, som muliggør, at de afbrudte DNA-strenge igen sættes sammen – af det samme enzyms ligase-aktivitet (sammenlimning).

Enzymet kan altså både klippe og sy sammen. Denne aktivitet er livsnødvendig for at kunne fjerne skadelige spændinger, som kan opstå i dobbeltstrenget DNA.

De indledende forsøg på måling af enzymaktiviteten fra malariaparasitten i en lille spyt-prøve ser lovende ud (ref.10705).

Forskerne ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik og Interdisciplinært Nanoscience Center ved Århus Universitet har videreudviklet RCA-teknologien til at ske i nano-dråber. Dermed har de frembragt den første diagnostiske test, som bygger på måling af en enzymaktivitet i den indtrængende organisme, her malariaparasitter (ref.10705).

Det regnes for mere sikkert at bygge en test på selve tilstedeværelsen af malariaparasitten end at forsøge at teste patientens immunreaktion eller eventuelle sygdomssymptomer.

Topoisomerase I stiller meget specifikke krav til den DNA-sekvens, den bindes til og spalter ved. Det er denne egenskab, der med stort held udnyttes i den nyudviklede metode (ref.10705). Enzymet varierer nemlig lidt fra organisme til organisme, og DNA-substratet tilsvarende. Denne forskellighed udnyttes i den nye testmetode.

Enzymet topoisomerase I er så vigtig for Plasmodium-arters overlevelse, at det ikke er gået tabt under evolutionen af Plasmodium-arterne. Der er således særdeles gode muligheder for at udvikle en specifik pan-malariatest, hvormed alle Plasmodium-arter kan påvises ved samme test.

Det er tidligere vist, at man kan måle human-TopI ved hjælp af RCA-metoden. De danske forskere fik så den idé, at de måske kunne måle TopI-­aktiviteten fra Plasmodium i prøver fra en malaria-inficeret person og relatere dette til tilstedeværelsen af parasitten (ref.10705).

Dette krævede, at man kunne skelne mellem topoisomerase I fra mennesket (hTopI), og topoisomerase I fra malaria-Plasmodiumparasitten (pTopI).

For at måle parasittens topoisomerase I blev der anvendt et reaktionskammer af ekstrem lille størrelse. Metoden kaldes på engelsk ”droplet microfluidics platform”.

Kombinationen af RCA og ”droplet microfluidics platform” viste sig at give en meget følsom og specifik påvisning af tilstedeværelsen af malariaparasitter (ref.10705).

Principperne i analysen er følgende: Hvis der er pTopI (fra parasitten) tilstede i en blodprøve, der er taget af et menneske, der mistænkes for at være smittet med malaria, vil dette pTopI-enzym klippe hul i et nøje udformet testsubstrat (DNA) – og vil efterfølgende lukke hullet igen.

Det pågældende testsubstrat indeholder to DNA-sekvenser, som har betydning for påvisningen af klip/sy-aktiviteten.

Det er vigtigt at forstå, at specificiteten i analysen ligger i, at man lige ­netop tilbyder et stykke substrat-DNA, som er specifik for DNA-klip/sy-enzymet fra den organisme, som man ønsker at afsløre tilstedeværelsen af. (Hvis man vil påvise hTopI-enzy­met, er det således et andet DNA-substrat, der skal anvendes, end hvis man vil påvise pTopI-enzymet). Man skal kunne skelne mellem dem, da der altid vil være hTopI tilstede, når man tester for pTopI.

Man tilfører et DNA-stykke, som kan fungere som primer for en DNA-polymerase. (Desuden tilfører man de til DNA-syntesen nødvendige fire typer af deoxyribonukleotider).

DNA-polymerasen kopierer nu det cirkulære DNA gang på gang – f.eks. 1000 gange. Den ene kopi efter den anden kommer derved til at ligge sammenkoblede som perler på en snor.

Den RCA-baserede test for malaria­infektion er så følsom, at den giver et positivt udslag ned til at der i gennemsnit kun er 0,06 parasit pr. mikroliter (ref.10705). (Dette kan sammenlignes med, at de mest optimale protokoller for PCR kan måle ned til 0,01-1 ­parasit pr. mikroliter (ref.10705)).

Metoden forventes at kunne anvendes til at teste for malaria i en lille spytprøve (ref.10705).