<DENNE ARTIKEL SKAL OPDELES OG NIVEAU-DELES>
===========================

Lungechip i mikrostørrelsemodel kan erstatte dyreforsøg

Lungefunktioner, hvor åndedrætsbevægelser har betydning, kan efterlignes i et mikrosystem

Lungechipmodellen har vist meget lovende resultater, og forskerne er derfor begyndt på udvikling af chipmodeller af hjertet, tarmen, knoglemarven og til kræft.

Lungechipmodel, der efterligner åndende menneskelunge

===========================

I et forsøg på at billiggøre afprøvninger af lægemidler og toksiske stoffer har forskere ved Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering ved Harvard universitet udviklet et biologisk inspireret chip-design, en lungechipmodel, der efterligner en åndende human lunge. Her kan lungefunktioner testes i et mikrosystem, som gengiver den kritiske funktionelle alveole/kapillær-interfase i den humane lunge, dvs. overgangen mellem lungens fine netværk af små luftsække (alveoler) og blodbanen. Lungechipmodellen i mikrostørrelse kan erstatte kostbare og tidskrævende dyreforsøg.

Der er tidligere udviklet mange modelsystemer i forsøg på at undgå dyreforsøg. Der er for eksempel udviklet avancerede cellekulturmodeller, som afspejler væv og organer, men her har det været vanskeligt at opretholde differentiering af cellerne og ekspression af vævsspecifikke funktioner. Systemet er forbedret ved at dyrke cellerne i geler med en tredimensional ekstracellulær matrix, men der er ikke opnået en gengivelse af vævets strukturelle og mekaniske egenskaber. Navnlig mangler gengivelse af den aktive væv/væv-interfase mellem det mikrovaskulære endothelium og det naboliggende parenkymale væv, hvor der sker kritisk transport af væsker, næringsstoffer, immunceller og andre regulatoriske faktorer. De kendte modeller gør det heller ikke muligt at påføre dynamiske, mekaniske kræfter svarende til åndedrætsbevægelser i den levende lunge, peristaltiske bevægelser i tarmen og lignende. Funktioner, der alle er kritiske for funktionen af levende organer.

Den nye lungechipmodel omfatter et mikrofluidsystem, der indeholder to modstående mikrokanaler adskilt af en tynd (10 mm) porøs, bøjelig membran fremstillet af poly(dimethylsiloxan) (PDMS). Denne mellemliggende membran er belagt med fibronectin eller collagen. På hver side af membranen dyrkes henholdsvis humane alveoleepitelceller og humane mikrovaskulære lungeendothelceller. Når cellerne dækkede arealet i mikrokanalerne i et monolag, indføres luft i rummet med alveoleepithelcellerne for at skabe en luft/væske-interfase for derved at give en mere præcis efterligning af det alveolære luftrum. Den opdelte konfiguration med to mikrokanaler og en separerende membran gør det muligt at regulere luftstrømmen og ligeledes at tilføre celler og næringstoffer uafhængigt til alveoleepithelcellerne og de mikrovaskulære lungeendothelceller.

Lungechipmodellen er fremstillet af gennemsigtige materialer, og man kan derfor iagttage, hvad der sker inde i systemet. Fysiologiske, åndedrætslignende bevægelser frembringes ved skiftevis at påføre og ophøre med et vakuum på sidekamrene, hvorved der sker en mekanisk strækning og afslapning af PDMS-membranen. Det har vist sig at være en god simulering af åndedrætsbevægelser. Når en levende lunge ånder ind, frembringer sammentrækning af mellemgulvet en reduktion af trykket i lungen, hvilket fører til udspiling af alveolerne og fysisk strækning af alveole/kapillær-interfasen.

Efterprøvning af et helt organs reaktioner i lungechipmodellen
Forløbet af en inflammation svarende til en lungeinflammation i en hel lunge blev undersøgt. Der blev tilført blodbårne immunceller i den væske, der strømmer gennem den vaskulære kanal. En lungeinflammation i en hele lunge sætter en hel kaskade af reaktioner i gang, herunder epithelial produktion og frigivelse af tidlige cytokiner, aktivering af vaskulær endothelium ved opregulering af leukocyt-adhæsionsmolekyler (f. eks. intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) med efterfølgende leukocyt-infiltration i det alveolære rum fra lungemikrocirkulering. Fordi cytokiner produceres af celler i lungeparenkym blev processen simuleret ved at indføre et medium indeholdende den potente proinflammatoriske mediator, tumor nekrosefaktor-a (TNF-a), i alveolemikrokanalen samtidig med fysiologisk, mekanisk påvirkning, Herefter blev det mikrovaskulære endothelium undersøgt ved at måle expression af ICAM-1. TNF-stimulering af epitheliet forøgede i væsentlig grad endothelial expression af ICAM-1 inden for 5 timer, hvorimod fysiologiske normale cykliske påvirkning ikke havde effekt på ekspression af ICAM-1. Det aktiverede endothelium fremmede også tæt binding af fluorescensmærkede humane neutrofile celler, der flød i den vaskulære mikrokanal, og som ikke hæfter til endothelium uden TNF-stimulering.

Efterligning af det medfødte immunsystem i lungechipmodellen
Forskerne viste også, at mikrosystemet kunne efterligne det medfødte cellulære svar på lungeinfektion af bakteriel oprindelse. Levende Echerichia coli bakterier, der udtrykte grøn-fluorescerende protein (GFP) hele tiden, blev tilført til alveolemikrokanalen. Tilstedeværelse af disse patogene organismer på den apikale overflade af alveoleepitheliet i 5 timer var tilstrækkelig til at aktivere det underliggende endothelium, hvilket fremgik ved indfangning af cirkulerende, neutrofile celler (hvide blodlegemer) og migration til alveole-mikrokanalen. Da de neutrofile celler nåede alveoleoverfladen, udførte de neutrofile celler en retningsstyret bevægelse mod bakterierne, som blev opslugt af de neutrofile celler over en periode på få minutter. De neutrofile cellers fagocytiske aktivitet fortsatte, indtil de fleste bakterier var fjernet fra observationsområdet. Således blev der i lungechipmodellen vist et normalt integreret cellulært svar på en mikrobiel infektion i humane lungealveoler.

Lungechipmodel til test af potentielt skadelige partikler i lungen
Skønt nanopartikler anvendes i udbredt grad, ved man ikke så meget om deres eventuelle sundhedsskadelige virkning og virkninger i miljøet. De kendte modeller til at vurdere toksikologi bygger på forenklede in vitro modeller eller langvarige og kostbare dyreforsøg. Derfor blev den nye lungechipmodel afprøvet ved test af effekten af nanopartikler i lungemiljøet. Nogle af nanopartiklerne findes i kommercielle produkter, andre i luft- eller vandforurening. Når nanopartikler tilføres til alveoler i et levende lungeorgan, bliver nanopartiklerne aflejret i et tyndt væskelag på overfladen af epitheliet. For at efterligne denne aflejringsmåde blev en nanopartikelopløsning indført i alveolemikrokanalen efterfulgt af forsigtig aspiration af opløsningen, så der på epitheloverfladen i lungechipmodellen kom til at ligge et tyndt væskelag indeholdende nanopartikler, og som dækkede epitheloverfladen. Når alveoleepithelceller i 5 timer udsættes for 12 nm silica-nanopartikler, som almindeligvis anvendes som model for toxiske virkninger af ultrafine luftbårne partikler, blev det underliggende endothelium i den mikrovaskulære kanal aktiveret og udtrykte høje niveauer af ICAM-1. Fysiologiske åndedrætsbevægelser havde i sig selv ingen indvirkning på ICAM-1 ekspressionen, men forøget mekanisk påvirkning forøgede den endotheliale ekspression af ICAM-1, som blev induceret af silica-nanopartiklerne. Denne virkning var tilstrækkelig til at inducere endothelial indfangning af cirkulerende celler og til at fremme deres transmigration over væv/væv-interfasen og akkumulering heraf på epitheloverfladen.

Det er tidligere blevet vist, at nanopartikler inducerer lungeinflammation ved at stimulere epithelceller til at producere proinflammatoriske cytokiner og ved at bringe endothelceller til at udtrykke ICAM-1 og rekruttere cirkulerende leukocytter. Med den nye lungechipmodel er der indikation for, at mekaniske, åndedrætslignende bevægelser i høj grad forøger silica-nanopartiklernes proinflammatoriske aktiviteter og i væsentlig grad bidrager til udvikling af akut lungeinflammation. Denne virkning af mekaniske åndedrætslignende bevægelser ville aldrig være blevet opdaget i statiske cellekulturer, hvor der ikke kan påføres en mekanisk påvirkning.

Herefter blev forskellige nanomaterialers evne til at inducere oxidativ stress undersøgt. Nanomaterialet blev tilført til alveolemikrokanalen, og det oxidative stresssvar blev mængdebestemt ved at måle intracellulær produktion af reaktive oxygenarter (ROS) ved hjælp af mikrofluorimetri. Når ultrafine (12 nm) silica-nanopartikler blev tilført til alveoleepitheliet i fravær af mekanisk påvirkning var der kun lidt eller ingen produktion af ROS. Men når cellerne blev udsat for mekanisk påvirkning med åndedrætslignende bevægelser inducerede de samme nanopartikler en stigning i ROS-produktion til mere end firedobbelt niveau inden for 2 timer. Denne reaktion kunne hæmmes med N-acetylcystein, et stof der kan opfange frie radikaler. ROS-niveauer i det underliggende endothelium steg også med en faktor på næsten 3 inden for 2 timer, men med en times forsinkelse. Transport af fluorescerende albumin forblev uændret under de samme betingelser. Således skyldes transporten af nanopartiklerne ikke en lækage i systemet.

Der er således opnået indikationer for, at mekanisk stress hidrørende fra åndedrætslignende bevægelser sammen med nanopartiklerne giver en synergistisk effekt og udviser tidlige toksiske effekter og accelereret nanopartikeltoksisitet i lungen. Den mekaniske påvirkning forøger cellulær optagelse af nanopartikler i alveoleepithelet og det underliggende endothelium.

Tilstedeværelse af en luft/væske-interfase på epitheloverfladen syntes ikke at fremkalde en væsentlig større mekanisk påvirkning eller ændring i nanopartikelabsorption over alveole-kapillær-barrieren i den nye lungechipmodel.

Sammenligning med en muselunge
For at finde ud af den fysiologiske relevans af de observerede resultater med lungechipmodellen, blev der udført lignende undersøgelser med tilføring af nanopartikler i en muselungeventilations-perfusionsmodel, hvor der kan injiceres en tåge af nanopartikler i luftrøret, og nanopartikeloptagelse i lungevaskulaturen blev målt. Når nanopartikler (20 nm) blev injiceret i en hel, åndende muselunge, blev nanopartiklerne ført dybt ind i lungen til alveolerne, og histologiske analyser viste, at nanopartiklerne nåede overfladen af alveoleepithelet, såvel som de underliggende mellemrum og mikrovaskulaturen. Disse resultater viser, at de anvendte nanopartikler transporteres over alveole-kapillærbarrieren in vivo, ligesom Wyss-forskerne fandt in vitro med lungechipmodellen. Forskerne målte antallet af absorberede nanopartikler opsamlet fra lungevenecirkuleringen efter at nanopartikler var blevet injiceret i den perfusionsbehandlede muselunge. Der blev fundet høj nanopartikeltransport fra alveolerne ind i mikrovaskulaturen i nærværelse af cykliske åndedrætsbevægelser in vivo, hvilket stemmer overens med de resultater, der blev opnået in vitro med lungechipmodellen med en mekanisk efterligning af åndedrætsbevægelser. Lignende undersøgelser af effekten af nanopartikler i de kendte stationære modelsystemer har kun vist et lavt niveau af nanopartikeltranslokation.

Fremtiden
Lungechipmodellen har vist så lovende resultater, at forskerne nu også arbejder med chipmodeller af hjertet, tarmen, knoglemarven og kræft. Der arbejdes også med kombinationer af organchipmodeller, f. eks. ved at kombinere en lungechipmodel med en hjertechipmodel. Med en sådan kombination forventer man at kunne måle inhalerede lægemidlers effekt på hjertet. Der er store forventninger til dette forskningsområde.

Kilder
Science 25 June 2010,Vol. 328. No. 5986, pp. 1662 – 1668, DOI: 10.1126/science.1188302 : Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip

http://www.eurekalert.org/pub_releases/2010-06/hms-rdl062110.php
New Scientist, 3. juli 2010, p 21

/ ejbn