Denne side er et supplement til
**BioNyt – Videnskabens Verden** nr.158

Du kan tegne abonnement på BioNyt: Videnskabens verden **her!**

Køb dette nr.

SPØRGSMÅL OG SVAR OM MALARIA:

Dele af denne side kræver abonnement

på BioNyt Videnskabens Verden

Ældre artikler:

Nogle spædbørn i Afrika får adskillige myggestik hver nat, og risikoen for at få malariasmitte er derfor stor. Når hidtidige forsøg på vaccination mod malaria er slået fejl, kan det derfor tænkes, at årsagen er for sen vaccination. Hvis barnet allerede er blevet smittet, virker vaccinen ikke. En malariavaccine kaldet "SPf66" mod den farligste af malariaparasitterne, Plasmodium falciparum, virker tilsyneladende i Sydamerika, men ikke i Afrika og Asien. For at blive en kommerciel succes er det afgørende, at vaccinen også virker på disse kontinenter (ref.1). SPf66" er et syntetisk peptid, der består af 4 forskellige peptider: Et fra parasittens sporozoit-stadie, et fra stadiet før blodlegeme-infektionen og to, der menes at stamme fra blodlegeme-stadiet. I en undersøgelse i det nordvestlige Thailand, hvor 1221 børn i alderen 2-15 år blev vaccineret med "SPf66", fandt man ingen virkning i forhold til en kontrolgruppe. I begge grupper var der omkring 190 malariatilfælde i løbet af 1½ år, men dog ingen dødsfald på grund af malaria. (I Thailand-undersøgelsen var halvdelen af malariatilfældene vivax-malaria. Børnene har dette sted i gennemsnit 1 malariainfektion hver 2.-3. år (ref.2)). Tidligere forsøg med denne vaccine har vist, at den ikke virkede på børn i Gambia, mens den tilsyneladende havde svag virkning i en Tanzania-undersøgelse og positiv virkning i en Sydafrika-undersøgelse. Vaccinen var effektiv i en undersøgelse fra Columbia i Sydamerika. Men på grund af Thailand-undersøgelsens negative resultat konkluderer forskerne, at der ikke er grund til at forsøge sig mere med denne vaccine. Den har skuffet for mange gange (ref.2). Når vaccination mod malaria er så vanskelig skyldes det malaria-antigenernes variabilitet (se Bio-Nyt nr. 47 om malaria). Der er heller ikke særlig gode forsøgsmodeller. Efter at man har kunnet dyrke Plasmodium falciparum i kultur er der dog kommet flere typer af vacciner. Vaccinerne er blevet rettet mod de forskellige parasitstadier: sporozoitten, merozoitten og gametocytten. På trods af talrige undersøgelser, undertiden ganske omfattende, har alle forsøg i praksis slået fejl på et eller andet punkt. Netop vaccinen "SPf66" var et lyspunkt, med 30-50% beskyttelse ifølge de første undersøgelser. Nu, da også denne vaccine øjensynlig har slået fejl, vender man sig mod andre vaccineformer, f.eks. DNA-vaccinen (se Bio-Nyt nr. 91 om Gen-vaccination). I et forsøg med mus og malariaparasitten Plasmodium yoolii opnåede man således 82-90% beskyttelse ved at bruge DNA-vaccination (ref.4). Beskytter en mild malaria? Der findes forskellige arter af malaria-parasitter. Plasmodium falciparum er den farligste. Måske kan det være en fordel af blive inficeret med en af de mildere arter i tidlig barndom, fordi man så måske er delvis beskyttet mod den farlige art senere i livet. Dette kunne i hvert fald være forklaringen på, at børn i Vanuatu i Stillehavsområdet ikke dør af malaria, selv om de gentagne gange smittes med Plasmodium falciparum. Børnene kan være blevet beskyttet, fordi de har modstået en mildere infektion af Plasmodium vivax. Kathryn Maitland og kolleger fra Institute of Molecular Medicine ved University of Oxford undersøgte 1700 børn fra øgruppen, og fandt at de blev smittet i gennemsnit 2 gange om året, men uden at nogen af børnene døde under den 2 år lange undersøgelse. Hos børn under 2-årsalderen var vivax-malaria hyppigst, mens falciparum-malaria var den hyppigste hos de større børn. Efter 5-årsalderen havde børnene ikke vivax-infektion, hvilket må skyldes, at de i den alder havde opnået immunitet mod sygdommen (ref.5). Man har længe haft den faste overbevisning, at immunitet mod én art malariaparasit ikke giver immunitet mod en anden art. Men hvis dette faktisk kan ske, vil det kunne forklare, at falciparum-malaria er så farlig for afrikanerne i forhold til andre steder, eftersom vivax-malaria er sjælden i Afrika. Afrikanerne har ikke mulighed for at blive beskyttet ved en tidlig vivax-infektion. En alternativ teori kunne simpelthen være, at den type falciparum-malaria, som findes på de isolerede øer i Stillehavet, er mindre farlig, siger Brian Greenwood fra London School of Hygiene and Tropical Medicine. Ref.1: New Scientist 21/9-1996 s.8. Ref.2: The Lancet, bd.348, 14/9-96 s.701-07. Ref.3: Cah-Sante 5/6, 1995 s.411-414 (Thomas P. Ambroise, Institute Sante et Developpement, 15/21 Rue de l'Ecole-de-Medecine, 75270 Paris Cedex 06, Frankrig). Ref.4: J.Exp.Med. 183/4, 1996, s.1739-46 (D.L.Doolan med flere [Naval Medical Research Institute, Bethesda, MD 20889-5607, USA]). Ref.5: New Scientist 21/9-1996 og møde afholdt af British Society for Parasitology, Glasgow sep. 1996.

n af de mest lovende måder at bekæmpe malaria på ville være at gøre myggene ude af stand til at sprede parasitten ved at udsprede genetisk modificerede myg. I et forsøg, hvor 4 stammer af genetisk ændrede myg, der i forsøget havde fået indsat et gen så de kunne genkendes (de var fluorescerende), viste, at deres stamme uddøde efter 4-16 generationer, når de var blandet med normale myg uden fluorescensgenet. Problemer var næppe genet, men indavl. Myggene klarede sig meget bedre i konkurrence med vildmyg, som var lige så indavlede som dem selv. Indavlsproblemet kan løses ved at gensplejse forskellige myggestammer. Der er tegn på, at malariaparasitter skader myggene, og derfor kan de parasitresistente GM-myg tænkes at klare sig bedre end vildmyg i naturen. New Scientist 1.marts 2003 s.19 (Science bd. 299 s.1227)

Hver 10. gen i materiaparasitten er plantegener, viser publiceringen af hele sekvensen af parasittens DNA samt DNA-sekvensen fra dens vært, Anopheles-myggen. Man kender ca. 500 plantegener, som ikke modsvares af gener i mennesket. Stoffer, som blokerer disse gener vil derfor næppe være skadeligt for mennesker. Omkring 550 af malariaparasittens 5300 gener koder for proteiner, som findes i et organel i parasitten, som kaldes apicoplasten. Denne er meget lig kloroplaster hos planter, som er de organeller hos planter, hvor fotosyntesen foregår. Eftersom malariaparasitten er et dyr mener man, at den udvikledes fra en organisme, som opslugte en alge, og lod denne leve videre i sig som en intern symbiont. Det er sket for hundrede af millioner år siden. Apicoplasten udfører ikke fotosyntese, men er stadig en vigtig del af parasittens biokemiske apparat. F.eks. danner den fedtsyrer, som er nødvendig for at parasitten kan invadere blodlegemerne, samt stoffer, som bruges til at danne energi. Opdagelsen åbner op for nye muligheder for at bekæmpe parasitten. Man har allerede vist, at herbicidet diclofop dræber parasitter i laboratorieforsøg. Mus er blevet helbredt for malaria med et andet herbicid, fosmidomycin. Det antimikrobielle middel triclosan, som bruges i mundskyllevand, har også vist en virkning. Når nogle bakteriedræbende midler også dræber parasittn kan forklaringen være, at kloroplaster (og altså derfor også apicoplaster) selv stammer fra fotosyntetiske bakterier. New Scientist 12.okt.2002 s.15, Nature og Science ugen før.

SPØRGSMÅL OG SVAR OM MALARIA
Supplement til BioNyt Videnskabens Verden nr. 158

sp?

svar. Malaria påvist ved en simpel spytprøve Cirkel-DNA metoden (RCA) er anvendt til test for malaria En dansk forskergruppe ved Århus Universitet har udviklet en RCA-­baseret test til påvisning af malariaparasitter i blod. Med RCA-metoden kunne de måle en bestemt enzym­aktivitet, som afslører malariaparasittens tilstedeværelse (ref.10705).

Forskerne ved Århus Universitet er de første forskere, der har videreudviklet RCA-metoden til måling af en enzymaktivitet. (Denne videreudvikling kaldes REEAD; eng: rolling circle enhanced enzyme activity detection) (ref.10715)(ref.10705). RCA-test for malaria-version af enzymet topo-isomerase I De danske forskere målte specifikt på aktiviteten af et for malariaparasitten livsnødvendigt DNA-klippe-og-lime-enzym, topo­isomerase-I, i en blodprøve. Enzymet topoisomerase I, som påvises i testen, er et enzym, der findes hos alle levende organismer, idet det er helt ­essentielt for organismens overlevelse.

Topoisomerase I (ofte kaldet TopI) fremmer (ved katalytisk enzym­aktivitet), at der sker brud på den ene streng i dobbeltstrenget DNA, hvorved der dannes et covalent enzym/DNA-mellemprodukt, som muliggør, at de afbrudte DNA-strenge igen sættes sammen – af det samme enzyms ligase-aktivitet (sammenlimning).

Enzymet kan altså både klippe og sy sammen. Denne aktivitet er livsnødvendig for at kunne fjerne skadelige spændinger, som kan opstå i dobbeltstrenget DNA.

De indledende forsøg på måling af enzymaktiviteten fra malariaparasitten i en lille spyt-prøve ser lovende ud (ref.10705).

Forskerne ved Institut for Molekylærbiologi og Genetik og Interdisciplinært Nanoscience Center ved Århus Universitet har videreudviklet RCA-teknologien til at ske i nano-dråber. Dermed har de frembragt den første diagnostiske test, som bygger på måling af en enzymaktivitet i den indtrængende organisme, her malariaparasitter (ref.10705).

Det regnes for mere sikkert at bygge en test på selve tilstedeværelsen af malariaparasitten end at forsøge at teste patientens immunreaktion eller eventuelle sygdomssymptomer.

Topoisomerase I stiller meget specifikke krav til den DNA-sekvens, den bindes til og spalter ved. Det er denne egenskab, der med stort held udnyttes i den nyudviklede metode (ref.10705). Enzymet varierer nemlig lidt fra organisme til organisme, og DNA-substratet tilsvarende. Denne forskellighed udnyttes i den nye testmetode.

Enzymet topoisomerase I er så vigtig for Plasmodium-arters overlevelse, at det ikke er gået tabt under evolutionen af Plasmodium-arterne. Der er således særdeles gode muligheder for at udvikle en specifik pan-malariatest, hvormed alle Plasmodium-arter kan påvises ved samme test.

Det er tidligere vist, at man kan måle human-TopI ved hjælp af RCA-metoden. De danske forskere fik så den idé, at de måske kunne måle TopI-­aktiviteten fra Plasmodium i prøver fra en malaria-inficeret person og relatere dette til tilstedeværelsen af parasitten (ref.10705).

Dette krævede, at man kunne skelne mellem topoisomerase I fra mennesket (hTopI), og topoisomerase I fra malaria-Plasmodiumparasitten (pTopI).

For at måle parasittens topoisomerase I blev der anvendt et reaktionskammer af ekstrem lille størrelse. Metoden kaldes på engelsk ”droplet microfluidics platform”.

Kombinationen af RCA og ”droplet microfluidics platform” viste sig at give en meget følsom og specifik påvisning af tilstedeværelsen af malariaparasitter (ref.10705).

Principperne i analysen er følgende: Hvis der er pTopI (fra parasitten) tilstede i en blodprøve, der er taget af et menneske, der mistænkes for at være smittet med malaria, vil dette pTopI-enzym klippe hul i et nøje udformet testsubstrat (DNA) – og vil efterfølgende lukke hullet igen.

Det pågældende testsubstrat indeholder to DNA-sekvenser, som har betydning for påvisningen af klip/sy-aktiviteten.

Det er vigtigt at forstå, at specificiteten i analysen ligger i, at man lige ­netop tilbyder et stykke substrat-DNA, som er specifik for DNA-klip/sy-enzymet fra den organisme, som man ønsker at afsløre tilstedeværelsen af. (Hvis man vil påvise hTopI-enzy­met, er det således et andet DNA-substrat, der skal anvendes, end hvis man vil påvise pTopI-enzymet). Man skal kunne skelne mellem dem, da der altid vil være hTopI tilstede, når man tester for pTopI.

Man tilfører et DNA-stykke, som kan fungere som primer for en DNA-polymerase. (Desuden tilfører man de til DNA-syntesen nødvendige fire typer af deoxyribonukleotider).

DNA-polymerasen kopierer nu det cirkulære DNA gang på gang – f.eks. 1000 gange. Den ene kopi efter den anden kommer derved til at ligge sammenkoblede som perler på en snor.

Den RCA-baserede test for malaria­infektion er så følsom, at den giver et positivt udslag ned til at der i gennemsnit kun er 0,06 parasit pr. mikroliter (ref.10705). (Dette kan sammenlignes med, at de mest optimale protokoller for PCR kan måle ned til 0,01-1 ­parasit pr. mikroliter (ref.10705)).

Metoden forventes at kunne anvendes til at teste for malaria i en lille spytprøve (ref.10705).

Ny viden om malaria Danske forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet har været førende i opdagelsen af, hvordan malariaparasitter undviger kroppens immunforsvar – og får lov til at hobe sig op i hjernen, hvilket ofte fører til dødbringende sygdom.

Den nye viden bringer en vaccine mod malaria inden for rækkevidde og styrker hele forskningsområdet.

Tidligere var det i Danmark svært at få økonomisk støtte til malariaforskning, fordi der i mange år har været fokus på kræftforskning. Desuden er langt de fleste personer, der får malaria, at finde blandt verdens fattigste, hvilket ikke har gjort det attraktivt at udvikle medicin og vaccine mod malaria. Trods dette er dansk malariaforskning epokegørende.

Malaria er udbredt i tropiske og subtropiske områder, specielt i Afrika. Der importeres 150-200 tilfælde af malaria til Danmark om året (ref.107019). Malaria er altså ikke en almindelig sygdom i Danmark, men danske forskere har i mange år været fremtrædende inden for malariaforskning på et internationalt højt plan. Malaria er et stort problem på verdensplan Malaria er en infektionssygdom, som skyldes en gruppe af malariaparasitter af slægten Plasmodium, hvoraf Plasmodium falciparum er den farligste for mennesker.

Plasmodium-parasitterne er encellede organismer, som kan leve som parasitter i bl.a. mennesket og i en bestemt stikmyg ved navn Anopheles (ref.107019).

Man regner med, at der i år 2010 opstod omkring 216 millioner nye malariatilfælde i verden, hvoraf omkring 655.000 havde dødelig udgang (ref.107019).

De fleste, der dør af malaria, er børn under 5 år. Børn er særligt sårbare, fordi de endnu ikke har en færdigudviklet, naturlig immunitet (ref.107019).

Malaria-parasitten skjuler sig for menneskets immunsystem i de røde blodlegemer En infektion med malaria-parasitter kan udvikle sig livstruende, fordi parasitterne har en evne til at undgå kroppens naturlige immunforsvar.

Parasitterne opformerer sig i de røde blodlegemer, og får de røde blodlegemer til at udtrykke et parasit-­afledt vedhæftningsprotein på overfladen af de røde blodlegemer (ref.10720). Dette parasitprotein bindes til celler i blodkarvæggen, og der kan ske roset-dannelse med binding af ikke-inficerede røde blodlegemer. Der sker også en blodplade-hjulpet sammenklumpning af inficerede røde blodlegemer. Disse forhold kan føre til blodprop.

Det har vist sig, at malariaparasitten er utrolig dygtig til at variere vedhæftningsproteinet, som kaldes PfEMP1-proteinet (P.falciparum-erythrocyte-membrane-protein-1). Der foregår et sandt kapløb om liv eller død. Der er således fundet omkring 60 varianter af proteinet (ref.10722).

Genet, der koder for PfEMP1-proteinet, blev klonet i 1995. Derved blev det muligt at studere vedhæftningen på molekylplan. Men der er rigtig mange parametre at undersøge.

Malariaparasitten bærer gener, der koder for mange varianter af vedhæftningsproteinet, og endothel-cellerne har rigtig mange klæbe-molekyler på celleoverfladen, dvs. molekyler, hvortil parasit-afledte proteiner kan binde sig (ref.10720). Kombinationerne er mange, og der skal derfor komplekse metoder til for at undersøge disse mange kombinationer. Den mulige malaria-vaccine Antistoffer mod de forskellige malaria-antigener, der dannes undervejs i malariaparasittens livsstadier i blodet, kan være vigtige for opnåelse af beskyttende immunitet og er derfor mulige vaccinekandidater (ref.10721).

I 2011 var forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet med til at undersøge, hvordan individer, der ikke tidligere har været i kontakt med malaria-smitte, ville reagere på malaria-smitte. Der blev testet 104 PfEMP1-domæner (fremstillet ved genteknologi). De blev testet i hollandske forsøgspersoner for at se, hvornår der kom et antistof-svar i forsøgspersonen. Hvis et PfEMP1-domæne fremkaldte et hurtigt antistofsvar, var det en potentiel kandidat til en vaccine (ref.10721).

Infektionen blev påført via myggestik fra Anopheles stephensi myg, der var inficeret med ét af de rekombinante PfEMP1-domæner.

Det var således et meget realistisk scenarie med en ”naturlig” infektions­metode. Forsøget blev stoppet, efter at malariaparasitten havde delt sig aseksuelt et par gange (for ikke at påføre forsøgspersonen for stor risiko for at få en ukontrollerbar malaria).

På trods af det meget korte infektionsforløb, blev der observeret PfEMP1-antistoffer i omkring 60% af forsøgspersonerne.

Dette resultat tegnede godt, men der kunne ikke etableres en sammenhæng mellem omfanget af infektionen og bredden af antistof-svaret. En af deltagerne udviklede kun antistoffer mod ét domæne, medens en anden udviklede antistoffer mod 38 domæner af de i alt 104 domæner. Malaria- parasitten helgarderer Malariaparasitten helgarderer sig ved at udtrykke de fleste domæner, når parasitten går ind i blodstadiet. Den kender jo ikke antistof-reaktionen hos den nye vært, så den vælger at være på den sikre side og sørge for, at stort set alle domæner bliver udtrykt samtidigt. Denne strategi giver malaria-parasitten gode muligheder for at overleve og fremkalde en kronisk infektion.

Epidemiologiske data tyder på, at alvorlig malaria er knyttet til visse velbevarede domæner af PfEMP1. Metodemæssigt er dette dog svært at undersøge. Forskere fra Center for Medicinsk Parasitologi ved Københavns Universitet kombinerede to metoder, som hver især ikke var helt gode, men som tilsammen gav et tydeligt resultat.

De fandt, at uanset hvilke symptomer et meget malaria-sygt barn havde, kunne de påvise, at transskription (DNA-aflæsning) af domæne cassette nummer 8 (DC8) var meget forhøjet. Der var også forhøjet transskription fra DC13-domænet. Deres forskning pegede således på to gode vaccinekandidater (ref.10722). Malariaparasit-bindingsstedet De danske forskere fulgte imidlertid også en anden angrebsstrategi. Hvis man kunne finde det sted i blodårerne, hvor malariaparasittens protein sætter sig fast, så kunne man arbejde på at forhindre, at røde blodlegemer med malariaprotein på ydersiden kunne sætte sig fast.

Hvis parasitholdige røde blodlegemer ikke kan hægte sig fast, vil de blive ført til milten (blodets rensningsanlæg) til tilintetgørelse, og parasitten vil gå til grunde(ref.10723).

Forskernes mål var således at finde ud af, hvilke af menneskets tusinder af receptorer i blodkarrene, som parasitterne bindes til. Det krævede screening af over 2500 proteiner.

Det første skridt var at genskabe hele PfEMP1-proteiner ved genteknologi i laboratoriet. Dernæst blev delstykker af hele PfEMP1-molekylet analyseret for binding til proteiner i cellevæggen af menneskets blodkar.

De danske forskere samarbejdede med det engelske firma Retrogenix, som har specialiseret sig i at få celler til at producere forskellige proteiner på cellemembran-overfladen.

Ved at teste det ene protein efter det andet fandt man ud af, hvilke af karvæggenes flere tusinde proteiner, som en oprenset version af malaria-parasittens PfEMP1-protein bindes stærkest til.

Dette pegede éntydigt på menneskets overfladeprotein EPCR (eng: endothelial protein C receptor).

EPCR-overfladeproteinet er en utrolig vigtig receptor i kroppen. Den sidder centralt i den signalvej, der kontrollerer både kroppens immunforsvar, cellevæggenes integritet og blodkoagulering. Hvis der sker en øget blodkoagulering i hjernen, er der stor risiko for dannelse af blodprop i hjernen. Blodpropper er en af hovedårsagerne til, at folk dør af hjerne­malaria (ref.10723).

Mulige mål for vacciner er altså blokering af parasittens DC8 og DC13 hæfteproteiner, og bindingen til menneskets EPCR-receptor.Der er store perspektiver ved spyttest-teknologi – som f.eks. hvis man ved simple spyttest i fattige udviklingslande kan teste for malaria.

Billig PCR-maskine Billige apparater kan godt være avancerede. Hollandske "biohackers" har udviklet en qPCR-maskine i skotøjsæske-størrelse til ca. 1500 kr. Apparatet hedder Amplino. Den kan ud fra en blodprøve påvise malaria, endog parasit-stammen. Hver prøve koster 5-6 kr. Apparatet skal afprøves i Zambia. For brugeren er testen simpel: Et prik i fingeren, bloddråben opsuges med en strimmel, som indsættes i apparatet og 20 minutter efter aflæses resultatet.

Apparatet har brug for enzymer, DNA-byggesten og korte DNA-stykker, som parres med malaria-DNA'et. DNA-proberne afgiver et fluorescerende signal, når de finder malaria-DNA. Der kan anvendes forskellige DNA-prober for hver malaria-stamme, og farvesignalet kan være forskelligt, så malaria-stammen også kan aflæses. Opkobling til Internettet muliggør cloud-dataindsamling og GPS-lokalisering, som viser smitteforekomsten i landet.

Ved de nuværende metoder til påvisning af malaria (mikroskopi eller hurtigtest-kit) bliver nogle smittede ikke diagnosticeret og malaria-stammen bliver ikke bestemt.

En malaria-infektion er særlig farlig for en gravid, som samtidig er smittet med HIV. HIV-virussets ødelæggelse af immunforsvaret medfører, at malariasygdommen bliver voldsom, og samtidig bliver der dannet flere HIV-virus i kroppen. I forvejen er gravide særlig udsatte for malaria, fordi immunsystemet er hæmmet på grund af graviditeten, og fordi malaria-parasitten kan gemme sig i moderkagen, så den er langt vanskeligere at påvise.

De fleste dødsfald på grund af malaria er hos børn under 5 år, fordi deres immunsystem endnu er svagt udviklet. Årligt dør omkring 655.000 mennesker, især børn, af malaria. 90% af disse dødsfald er i landene syd for Sahara. Der foretages årligt ca. 16 millioner diagnoser for malaria, men behovet er ca. 1500 millioner. Ukorrekt diagnose kan medføre dårlig udnyttelse af midlerne mod malaria og udvikling af resistens hos parasitten.

Det billige PCR-apparat vil også kunne udvikles til påvisning af bakterier og virus, bl.a. HIV.

Læs hele artiklen om malaria i BioNyt Videnskabens verden, nr.158